谢春琴，曹正，范军民，徐俊琪，贾俊*

通讯作者。邮箱：xiechunqin@163.com

江苏农林职业技术学院生物工程系，江苏句容 212400

摘要

[目的] 研究不同培养条件对野生蝉花液体菌种生长的影响。[方法] 将蝉花菌种接种至含不同碳源、氮源、微量元素及pH的液体培养基中，于19℃、120 r/min的恒温摇床中培养，比较不同处理下菌丝球直径、密度及重量。[结果] 结果表明，蝉花液体菌种的最佳培养基成分为可溶性淀粉、奶粉和维生素B12，最适pH为5.0-6.0。[结论] 可溶性淀粉是蝉花液体菌种培养基最适碳源；奶粉是蝉花液体菌种培养基最适氮源；蝉花菌丝生长的最适pH为5.0-9.0；确定了液体菌种生长的最佳培养基配方及配比。

关键字：野生蝉花，液体菌种，培养基

1 引言

蝉花（Isaria cicadae Miquel）是寄生于蝉若虫及虫体上的真菌复合体[1]，属于虫草科。其同物异名包括Cordyceps cicadae (Miq.) Massee和Paecilomyces cicadae Samson[2]。野生蝉花资源稀少，通过人工培养技术可将野生资源转化为可持续利用的药用资源，实现保护与利用的结合。人工培养的蝉花不含重金属，比天然冬虫夏草更安全。

蝉花的主要活性成分与冬虫夏草相似[3-5]，包括甘露醇、蝉花多糖CT-4[6]、D-甘露醇[7]、杨梅素（ISP-1）[8-11]、麦角甾醇、过氧化麦角甾醇[12-14]、环肽化合物[15]、半乳甘露聚糖C-3[3]及虫草酸（甘露醇）等，对多种疾病具有良好疗效，如辅助治疗糖尿病[16]。

蝉花菌种的主要生产方式包括液体培养和固体培养[6]，其中液体菌种生长周期短，便于规模化生产[16]。但目前蝉花液体菌种的生产方法多基于冬虫夏草[17-18]，关于蝉花液体菌种营养及成分配比的研究较少。本实验旨在研究最佳碳源、氮源、微量元素及培养基初始pH对野生蝉花液体菌种菌丝生长的影响，为蝉花标准化、规模化及工业化人工培养提供优质种源。

2 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 菌种来源

蝉花菌种由江苏农林职业技术学院与江苏省食用菌研究所从江苏句容瓦屋山林场采集的野生蝉花中通过组织分离法获得。

2.1.2 试剂

实验所用试剂见表1。

2.1.3 仪器

DHZ-DA恒温振荡器、PL203梅特勒电子天平、PRX-250A恒温培养箱、超净工作台、YX-400A高压蒸汽灭菌器等，由江苏省食用菌研究所提供。

2.2 方法

通过测定不同碳源、氮源、微量元素及pH对蝉花液体菌种菌丝球密度、直径及生物量的影响，筛选最佳液体培养条件，并优化培养基配方。

2.2.1 基础培养基配方

蝉花液体菌种基础培养基：葡萄糖20 g；蛋白胨10 g；磷酸二氢钾0.5 g；硫酸镁1 g；维生素B1 10片；水1 000 mL。

2.2.2 碳源培养基优化

以等量麦芽糖、蔗糖、乳糖和可溶性淀粉分别替代基础培养基中的葡萄糖作为碳源，其他成分不变。

2.2.3 氮源培养基优化

以等量酵母提取物、奶粉、尿素、氯化铵分别替代基础培养基中的蛋白胨作为氮源，其他成分不变。

2.2.4 微量元素培养基优化

以等量维生素B2、B6、B12替代基础培养基中的维生素B1，其他成分不变。

2.2.5 pH优化

在最佳碳源、氮源及微量元素条件下，用柠檬酸（2 mol/L）和NaOH（1 mol/L）调节培养基pH至1-10，灭菌后备用。

2.2.6 最佳培养基配方优化

基于上述实验，将最佳碳源、氮源及微量元素按不同倍数（0.5倍、2倍、4倍、6倍）添加到基础培养基中，筛选最佳配比。

2.2.7 液体培养基制备

按常规方法配制液体培养基，分装至三角瓶（100 mL/瓶），灭菌后备用。

2.2.8 接种与培养

无菌操作下接种两块直径0.5 cm的菌饼，19℃静置培养24 h后，120 r/min摇床培养。

2.2.9 测定项目与方法

（1）菌丝球直径：接种48 h后，每24 h测定一次，随机选取30个菌丝球测量直径。（2）菌丝球密度：计数1 mL培养液中的菌丝球数量。（3）菌丝生物量：测定3 mL培养液中菌丝球的重量。（4）pH测定：无菌条件下用pH计测量。

3 结果与分析

3.1 不同碳源对蝉花菌丝生长的影响

可溶性淀粉为最佳碳源，菌丝生长量和密度分别是基础培养基的14倍和4倍（表2）。菌丝生长速度排序为：可溶性淀粉 > 乳糖 > 麦芽糖 > 葡萄糖 > 蔗糖（图1）。

3.2 不同氮源对蝉花菌丝生长的影响

奶粉为最佳氮源，菌丝球直径和密度均显著高于其他氮源（图2）。尿素几乎无促进生长作用。

3.3 不同微量元素对蝉花菌丝生长的影响

维生素B₁₂的促进作用最显著（图4），菌丝生长优于其他B族维生素。

3.4 不同初始pH对蝉花菌丝生长的影响

pH 5.0~9.0时菌丝生长最佳，其中pH 5.0~6.0时菌丝密度最高（表3）。

3.5 最佳培养基优化

基础培养基（CK）中菌丝生长最佳，营养减半时生长最差（图6）。

4 结论

可溶性淀粉为最适碳源。

奶粉为最适氮源。

维生素B₁₂为最适微量元素。

最适pH为5.0~6.0。

最佳培养基配方：可溶性淀粉20 g；奶粉10 g；磷酸二氢钾0.5 g；硫酸镁1 g；维生素B₁₂ 10片；水1 000 mL。

蝉花液体菌种培养3~4天时菌丝生长最旺盛，是规模化生产的最佳接种时期。

参考文献

[1] 滕超英, 宋铁龙, 关志华. 蝉花人工培养研究进展[J]. 内蒙古中医药, 2012, 31(12): 111-112.

[2] 董彩虹, 李卫杰, 李增智. 中国虫草产业现状、挑战与展望——金湖虫草产业发展宣言[J]. 菌物学报, 2016, 35(1): 1-15.

……（其余参考文献略）